当我们纯化蛋白时，最重要的就是要保持蛋白在纯化过程中不能失活，或者是尽量降低纯化过程对蛋白活性带来的损失。这就意味着蛋白在整个纯化过程中要始终保持可溶性和活性。

因此设计一个防止蛋白降解和聚合的蛋白纯化缓冲体系就非常重要了，尤其会凸显在实验结果上。在设计缓冲buffer时应考虑以下几个因素：pH值、缓冲体系、盐离子、还原剂和稳定剂。其中每一个因素都要根据你的目的蛋白进行优化，并以目的蛋白的活性作为优化的评估标准。

1.pH

很多实验的pH值设定在 7.4以模仿生物条件。假如你的蛋白在这个pH值下是稳定的，那就非常棒了！如果不是，就需要改变pH值找到目的蛋白在溶液中处于可溶性且不会降解的状态。

一个经验法则是：蛋白在它等电点pI附近的pH值溶液中会表现得不易溶解，因为蛋白在其等电点的pH值溶液中表面没有净电荷，从而容易聚集。这里推荐用Expasy的ProtParam工具快速简便地计算蛋白等电点pI值，只要提交蛋白序列即可。

2.缓冲体系

一旦确定了缓冲液的pH值，就需要选择使用什么样的缓冲体系。首先是在选择缓冲体系时要确保选择的缓冲体系在你设定的pH值上确实具有缓冲能力。选择的缓冲体系，其解离常数pKa值应该在设定的pH上下一个pH值单位内。

再者是确保你使用的缓冲液浓度足够高以达到实际缓冲溶液的作用，正常一般选择的浓度是20~100mM。需要记住的是你所使用的缓冲体系不应该影响蛋白活性！例如，磷酸盐会抑制激酶的活性，所以反应前应彻底地透析掉。

此外，一些缓冲体系对温度非常敏感，例如Tris-HCl缓冲液，如果你在25℃时将缓冲体系调至pH值8，pH值将在5℃时增加到8.58而在37℃时降到7.71。所以，如果打算在4℃条件下保存蛋白或在37℃进行实验，就应该考虑到室温下调的pH值可能在实验条件中就不适用了。

3.盐离子

许多缓冲液中含有NaCl，以帮助保持蛋白的可溶性和模拟生理条件。一般常用150 mM的NaCl。

在不同的蛋白纯化步骤中，可能需要改变盐离子的浓度。例如，如果是通过离子交换层析进行蛋白纯化，一开始需要降低盐离子的浓度（5~25mM）避免高离子强度和蛋白竞争和填料结合，这样可防止蛋白从离子交换柱中流穿，从而使柱子能够结合目的蛋白，洗脱除去杂蛋白。

其他类型的色谱分离柱，如凝胶过滤柱和Ni2+ 亲和层析柱，可能需要更高的盐浓度。

如果你的蛋白质含有半胱氨酸残基，半胱氨酸残基间的氧化可能会成为一个trouble，并可能导致蛋白聚集。为了防止这一点，往往会在缓冲液中添加一些还原剂，如DTT，TCEP或者巯基乙醇。

总的来说，TCEP是这三个还原剂中最稳定的，但它也是最昂贵的。我通常在纯化过程的缓冲液中添加DTT，在最后保存酶液的缓冲液中添加TCEP。一般比较合理的还原剂浓度是5~10mM。基本上你要确保还原剂浓度要远远高于你的蛋白浓度。因为DTT和巯基乙醇在室温下就会降解，所以需要将添加了还原剂的缓冲液处于低温保藏，或者在使用时再添加还原剂。

使用时确保柱材料能够与这些还原剂相容。虽然柱子很容易进行再生，但你的蛋白挂载量将会受到很大影响。许多柱材料都会列出其所能够承受还原剂的最大浓度，但是我觉得或多或少都会产生影响，并不在于是否达到最大浓度值。

5.稳定剂

最后，可以通过添加一些稳定剂到蛋白纯化缓冲液中，以帮助提高蛋白纯化时的溶解度和稳定性。在缓冲液中添加惰性蛋白BSA某种程度可以稳定蛋白，但必须确保这些加入的稳定蛋白不干扰实验。有时添加甘油、聚乙二醇等添加剂可以增加缓冲液粘度，有助于防止蛋白聚集。另外，使用少量的表面活性剂和一些离子化合物如硫酸盐、氨基酸、柠檬酸等可以屏蔽蛋白间的离子相互作用，帮助蛋白溶解。
通过调整蛋白纯化缓冲液的pH、缓冲体系、盐离子、还原剂和稳定剂，可以建立一个完善的蛋白纯化缓冲体系，可以保持蛋白在纯化过程中的活性和稳定性！这一生产调整非常有利于蛋白产品、酶制剂产品以及抗体药物产品分离纯化后处理的生产工艺开发！